咖啡酸(CA)衍生的苯乙酯(CAPE)和苯乙酰胺(CAPA)是广泛研究的生物活性化合物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等治疗作用。CAPE是具有潜在生物治疗活性的多酚成分之一，可以在微摩尔浓度下抑制多种癌症，已被公认为候选药物。CAPA也显示出强大的抗氧化性能，其酰胺结构与CAPE相比，稳定性明显提高。然而，这类化合物的大规模获取是困难的，只能从少量的天然物质中提取，如蜜蜂的蜂胶，而且其合成途径尚不清楚。虽然这种结构可以化学合成，但使用有毒化学试剂甚至致癌试剂不利于可持续发展。考虑到产品提取天然来源的限制和化学合成所用试剂的环境毒性，构建生产CAPE或CAPA的微生物细胞工厂是一个很有前途的选择。

图1. 在酵母中实现咖啡酸衍生苯乙酯和苯乙酰胺从头合成

2023年11月28日，天津大学系统生物工程教育部重点实验室主任、物质绿色创造与制造海河实验室首席科学家元英进院士团队在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Yeast Metabolic Engineering for Biosynthesis of Caffeic Acid-Derived Phenethyl Ester and Phenethyl Amide”的研究论文，基于先前在酵母中成功生物合成咖啡酸的工作，该团队进一步在酵母中构建了CAPE和CAPA的下游合成途径。通过理性的代谢通路设计和基于文库的SCRaMbLE方法对酵母底盘进行组合优化，最终获得了生产CAPE为417 μg/L和CAPA为1081 μg/L的最佳菌株。同时，筛选到的两个基因靶点ΔHAM1和ΔYJL028W也有助于提高目标产物的合成能力。该研究是在工程酵母底盘中从头合成CAPA的首次报告。

图2.酵母中构建CAPE和CAPA从头合成途径

基于先前构建的两步合成咖啡酸（CA）的途径，研究人员首先引入At4CL构建咖啡酰辅酶A合成路径。接下来，通过引入2-酮酸脱羧酶（KivD）和苯丙氨酸脱羧酶（LbPDC）分别在酵母中实现苯乙醇和苯乙酰胺的合成。最后利用酿酒酵母的天然Eht1作为O-ATF（酰基转移酶）和辣椒来源的CaTHT作为N-ATF，分别合成CAPE和CAPA。

图3. 初步构建的CAPE和CAPA代谢通路测试

接下来，研究人员通过直接添加葡萄糖，进行初步酵母合成CAPE和CAPA的通路测试，发现在两条路径中都没有检测到最终产物CAPE和CAPA，推测可能是因为酵母底盘提供的芳香底物不足以合成相关产物。因此，通过在发酵中添加其余特定的底物验证酵母细胞表达酶的活性。结果表明，在CAPE途径中，通过添加苯乙醇和咖啡酸能够检测到最终产物；而在CAPA途径中，当对香豆酸和咖啡酸同时存在时，4CL会优先催化对香豆酸，导致最终生成对香豆酰苯乙酰胺（pCoPA）。

图4. 添加特定的底物检测CAPE和CAPA途径的酶活性

为了使细胞产生比对香豆酸更多的咖啡酸，研究人员构建了两个具有柔性连接肽GGGGS的融合基因，即At4CL-linker-CaTHT和CaTHT-linker-At4CL。结果显示，两种融合蛋白的表达使pCoPA产量减半，并且含有At4CL-linker-CaTHT质粒的菌株能使酵母合成CAPA，但产量非常低。接下来，研究人员采用石英砂震荡直接破碎细胞进行目的产物提取优化，并通过启动子更换延迟诱导4CL的表达，将细胞从pCoPA合成部分地转移到CAPA合成。

图5. 酵母底盘调节芳香代谢途径的染色体进化

由于酵母合成的芳香氨基酸远远不足以支持CAPE和CAPA的合成，引入异源途径的工程酵母只有在培养基中加入特定的底物时才能合成相应的产物。为此，研究人员构建了含有酪氨酸和色氨酸下游合成途径的酵母菌，来直观地筛选芳香氨基酸合成上调的菌株。通过6轮SCRaMbLE筛选，筛选出了芳香族氨基酸产量显著增加的菌落文库，并进一步分析了所选优势菌株芳香产物的调控变化，最终发现ΔHAM1和ΔYJL028W能使两种芳香氨基酸的合成效率提高2倍以上。

图6.酵母底盘生产CAPE和CAPA的组合优化

最后，由于这些选定的靶点对芳香氨基酸生产的促进还不足以使酵母细胞摆脱依赖前体供应来合成最终产物的困境。因此，研究人员还通过合理的途径工程也被用于促进芳香环结构的合成。总之，在酵母中构建咖啡酸合成体系的基础上，该研究首次构建了酵母在最小SC培养基上从头合成CAPE和CAPA的途径，通过引入了至少11个基因(包括5个内源基因和6个外源基因)，以优化咖啡酸衍生酯和胺的合成。还研究了染色体结构变化对酚类化合物合成的影响，发现不同片段的缺失、翻转、复制和非整倍化的聚合有助于促进特定芳香产物的合成。这项工作有助于改善生产咖啡酸衍生物的微生物细胞工厂，并为生产具有类似结构的抗氧化和抗癌产品提供了重要的思路。

 

来源：解码合成生物