董敏组JACS：揭示土壤细菌产含砷抗生素的酶机制
2024-08-10
胂丝菌素（arsinothricin，AST）是由土壤细菌产生的一种具有广谱抗菌活性的含砷抗生素。胂丝菌素生物合成的关键步骤C-As键构筑被预测是由ArsL蛋白催化。ArsL具有保守的CxxxCxxC结构域，被归类为SAM自由基酶，然而ArsL的反应活性和机制未知。近日，物质绿色创造与制造海河实验室科研骨干、天津大学董敏教授课题组以实验室为完成单位在美国化学会志JACS在线发表了题为“Arsinothricin Biosynthesis Involving a Radical SAM Enzyme for Noncanonical SAM Cleavage and C-As Bond Formation”的研究论文。本研究发现ArsL催化非经典的SAM切割反应，通过产生ACP自由基，与底物亚砷酸反应产生AST-OH，进而在甲基转移酶ArsM作用下最终产生胂丝菌素。还发现ArsL C端结构域RCCLKC对底物识别有重要作用。ArsL蛋白是迄今发现的首个具有经典的SAM自由基酶CxxxCxxC结构域，但不产生5´-脱氧腺苷自由基，而通过切割SAM产生ACP自由基的SAM自由基酶。该发现预示SAM自由基酶家族可能有更多类似酶存在。
图1胂丝菌素可能的生物合成途径。
砷是广泛分布于自然界的有毒准金属元素，主要以无机砷的形式存在。细菌可将无机砷转化为有机化合物由此降低毒性，如甲基砷酸等。胂丝菌素是在土壤细菌Burkholderia gladioliGSRB05代谢物中发现的一种含砷有机物，其结构与谷氨酸类似，因此可作为谷氨酰胺合成酶抑制剂，具有抗菌抗病毒活性。其生物合成涉及两个蛋白ArsL和ArsM。推测ArsL催化第一步反应，切割辅因子SAM产生ACP，并与底物亚砷酸反应催化C-As键的形成，产生AST-OH；甲基转移酶ArsM催化第二步反应，负责AST-OH甲基化形成AST，如图2。
图2（A） 推测胂丝菌素生物合成途径。（B）经典SAM自由基酶和非经典SAM自由基酶Dph2催化的SAM切割反应
ArsL含有保守的CxxxCxxC结构域，因此被预测为SAM自由基酶家族成员。SAM自由基酶通过CxxxCxxC结构域与[4Fe-4S]簇结合。还原的[4Fe-4S]+簇切割SAM生成5´-脱氧腺苷（5´-dA）自由基，进而攫取底物氢原子产生底物自由基催化下游反应。目前只有白喉酰胺生物合成中的非典型SAM自由基酶（不含保守CxxxCxxC结构域）Dph2通过自由基机制切割SAM产生ACP自由基，修饰底物蛋白EF2（图2）。此外，许多酶通过亲核机制裂解SAM催化ACP转移反应。
本文作者通过一系列体外实验证实ArsL蛋白能通过自由基机制催化非经典SAM切割反应。ArsL蛋白在还原剂连二亚硫酸钠（DT）参与下能切割SAM的 Cγ,Met-S键产生MTA。在HPLC-HRMS直接检测及衍生化反应条件下均检测到L-高半胱氨酸亚磺酸（DT淬灭ACP自由基产物）。（图3,4）在柠檬酸钛（III）作为还原剂时检测到2-氨基丁酸产生。证明ArsL蛋白能催化非经典SAM切割反应。
图3 ArsL的SAM裂解反应。（A）还原的ArsL切割SAM产生MTA。（B）总反应中分离的MTA质谱。
图4 DT淬灭的ACP自由基产物HSA的检测。（A）LC-MS检测反应中HSA。（B）HSA质谱数据（13.3 min）。（C）HPLC检测反应DNFB衍生化。（D）HSA衍生化质谱。
在底物亚砷酸存在的反应中，不同还原剂催化的反应有显著差异。其中，DT作为还原剂时，虽然切割SAM产生MTA量最多，但是衍生化反应发现产物AST-OH量最低。这是因为DT与底物结构相似，和底物之间存在竞争关系。MV/NADPH以及柠檬酸钛做还原剂都有大量产物AST-OH产生。（图5）在ArsL与ArsM的串联反应中检测到了终产物AST（图6）。
为进一步研究该类酶的特性，我们进行blast序列分析，发现ArsL C端保守序列RCCLKC，通过序列截短和半胱氨酸突变证明了此段序列对底物识别的重要性。NCBI数据库中含有RCCLKC-tail SAM自由基酶家族(NCBI HMM accession NF040542.1)，我们推测该家族成员均能催化非经典SAM切割反应。
图7 推测的ArsL反应机制
综上，实验证明了SAM自由基酶ArsL能催化非经典SAM切割反应产生ACP自由基，并通过ArsM串联，体外重构了AST生物合成。（图7）ArsL蛋白是目前发现唯一的含有保守基序CxxxCxxC，并通过自由基机制催化非经典SAM切割反应的SAM自由基酶，预示着该家族可能有更多类似酶通过产生ACP自由基催化反应。
天津大学硕士研究生姚亚娣和何家乐为论文的共同第一作者，物质绿色创造与制造海河实验室科研骨干、天津大学董敏教授为论文的通讯作者。
来源：研之成理
